La enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC) es una enfermedad con afectación neurológica y visceral de carácter grave y evolutivo. Presenta una herencia autosómica recesiva con una prevalencia estimada de 1:150.000 individuos en Europa Occidental. 

Bioquímicamente, esta enfermedad se caracteriza por una acumulación de colesterol libre (no esterificado) en los lisosomas de las células de diversos tejidos así como de esfingolípidos en hígado o cerebro (Vanier 1999). Parece que éste acúmulo del colesterol no esterificado se debe a una anomalia en el transporte del colesterol exógeno afectando a la homeostasis de éste lípido. 
Las manifestaciones clínicas de esta enfermedad son heterogéneas. En la mayoría de los casos existe un deterioro progresivo neurológico y en la mayoria una afectación hepática importante, que en algunos pacientes puede llegar a ser letal. 

Por otro lado, la progresión de la enfermedad así como la edad de inicio también son variables encontrándose formas de inicio neonatal y lactantes, formas juveniles, hasta formas de aparicion en la edad adulta. 

Típicamente, la enfermedad de NPC se caracteriza por hepatosplenomegalia en grado variable, oftalmoplejia supranuclear vertical, ataxia progresiva, distonía y deterioro todos estos síntomas configuran lo que se conoce por el fenotipo "clásico", en edad de inicio durante la infancia y fallecen en la segunda o tercera década. Otros fenotipos incluyen presentaciones con ascitis fetal, grave afectación hepática neonatal, hipotonía y retraso en el desarrollo motor. Finalmente, las formas adultas se caracterizan mayoritariamente por trastornos psiquiátricos que pueden progresar hasta la demencia. 

A pesar que no se conoce la localización y naturaleza exacta del defecto(s) en el metabolismo del colesterol, por estudios de hibridación con células y análisis de ligamiento se sabe que en la enfermedad de NPC existen dos grupos de complementación, NPC1 y NPC2. El grupo de complementación NPC1 incluye aproximadamente el 95% de los pacientes. En ellos, el defecto primario es consecuencia de mutaciones en el gen NPC1 localizado en el brazo largo del cromosoma 18 en posición 11-12 (18Q11-12) (carstea Et Al., 1997). el grupo NPC2 incluye el resto de pacientes, en los cuales se ha visto que el defecto molecular primario se localiza en el gen HE1 localizado en posición 24.3 del brazo largo del cromosoma 14 (14Q24.3) (naureckiene Et Al., 2000) 

El hecho de que estos dos grupos de complementación no puedan distinguirse ni por el fenotipo clínico, celular ni bioquímico, ha llevado a la conclusión de que los productos de ambos genes deben funcionar en tandem o secuencialmente (Vanier Et AL., 1996; Carstea Et Al., 1997). 

El gen NPC1 tiene un tamaño de 47 KB y está formado por 25 Exones (Morris Et Al 1999) y el CDNA codificante para la proteína NPC1 que consta de 1278 aminoácidos. El análisis topológico de la proteína NPC1 revela que consta de 13 dominios transmembrana, 3 grandes dominios a nivel luminal, seis pequeños lazos y una cola citoplásmicos. Existen una serie de estudios que indican que esta proteína NPC1 podría jugar un papel fundamental modulando el tráfico vesicular del colesterol y de los glicolípidos (Neufeld Et Al., 1999, Blanchette-mackie 2000, Zhang Et Al., 2001). Por otro lado, en un trabajo de reciente publicación se describe que esta proteína podría ser una permeasa que actuaría como una bomba transmembrana (Davies Et Al., 2000). 

Actualmente, sólo existen cuatro publicaciones que describen mutaciones en el gen NPCI. Estas son heterogéneas e incluyen mutaciones puntuales y corrimientos de pauta de lectura de la proteína, consecuencia de pequeñas deleciones/inserciones. Entre las mutaciones puntuales, cabe destacar la mutación I1061T que se ha encontrado con relativa frecuencia en pacientes franceses y que tiene una buena correlación con el fenotipo juvenil de la enfermedad (Millat Et Al., 1999) 

Respecto a los pacientes pertenecientes al segundo grupo de complementación, actualmente sólo se han descrito dos pacientes con mutaciones en el gen HE1 (Naureckiene Et Al., 2000). Uno de ellos es homocigoto para una mutación Missense localizada en el Exón 1 y el otro compuesto heterocigoto para esta misma mutación y una pequeña deleción localizada en el Exón 2.

1.- Establecer el diagnóstico bioquímico preciso en aquellos pacientes con sospecha clínica de enfermedad de Niemann-Pick tipo C. 
Se realizará: 

a) Estudio del acumulo de colesterol libre en fibroblastos cultivados por tinción citoquímica con filipina (Kurt Et Al., 1986). 
b) Estudio de la actividad estfingomielinasa en fibroblastos. La gran mayoría de pacientes con NPC muestran déficit parcial de esta hisdrolasa ácida. 
c) Estudio del acumulo de colesterol libre según metodología Vanier (Vanier Et Al., 1991) para estudiar el fenotipo variante en aquellos pacientes en los que el estudio del acumulo de colesterol libre por tinción citoquímica con filipina sea negativo y exista un cuadro clínico compatible.

2.- Ofrecer a los familiares sanos de los pacientes un consejo genético apoyado con el diagnóstico de portadores y poder ofrecer cuando se requiera un diagnóstico prenatal. 
Este apartado comporta: 

a) 1.- Análisis de las mutación prevalente I1061T situada en el Exón 21 del gen NPC1 en pacientes españoles. 
2.- Búsqueda de las mutaciones responsables de la enfermedad en el gen NPC1 en aquellos pacientes en los que no se haya encontrado la mutación antes mencionada o en los que sólo se haya encontrado en hetrocigosis. Este apartado comporta amplificación por PCR de cada Exón del gen y de zonas flanqueantes mediante "Primers" adecuados, electroforesis siguiendo la tecnología de los SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms) para detección de mutaciones y secuenciación.

b) Una vez identificado el genotipo de cada caso índice (paciente), realizar los estudios mutacionales en los familiares para identificar los portadores.

c) En caso de no encontrar mutaciones en el gen NPC1, realizar la búsqueda en el gen HE1 para identificar los pacientes del grupo de complementación NPC2. Este estudio se realizará siguiendo protocolos análogos a los utilizados para la detección de mutaciones en el gen HE1.

d) Una vez identificados los genotipos de estos otros casos índices, proceder al estudio mutacional de sus familiares para identificar los portadores.

3.- Para poder establecer una correlación entre las diferentes mutaciones (genotipo) y las diferentes formas de inicio y evolución clínica (fenotipo). precisamos a) crear un protocolo para la elaboración de una base de datos, que conste la afectación multisistémica y quede reflejada la evolutividad de la enfermedad. b) Crear un "check list" para poder determinar el grado de severidad de la enfermedad.

Sujetos de estudio: 
Todos los pacientes remitidos por los distintos hospitales nacionales que acudan a nuestros centros con sospecha clínica de enfermedad NPC así como todos los pacientes ya diagnosticados.

Protocolo clínico y bioquímico: 
Se confeccionará un protocolo clínico y bioquímico básico que se enviará a los médicos responsables de pacientes NPC. Divulgación del mismo por todos los hospitales de ámbito nacional.

Análisis bioquímicos:
Detección de los acumulos de colesterol libre por técnica citoquímica mediante utilización de filipina (Kurth Et Al., J. Biol. Chem. 261:16769-16774, 1986; Vanier Et Al., Bba 1096:328-337,1991)

Análisis moleculares:
Estudio de la mutación I1061T en pacientes españoles diagnosticados de NPC según metodología descrita por Millat (Millat Et Al., Am J. Hum. Genet. 65:1321-1329, 1999). Análisis de mutaciones en el gen NPC1 según metodología descrita por Morris (Morris Et Al., Bbrc261:493-498, 1999). Análisis de mutaciones en el gen HE1 según metodología descrita por Naureckiene (Naureckiene Et Al., Science 290:2298-2301, 2000).

Aplicación del "check list" clínico: para clasificar a los pacientes según su afectación sistémica y gravedad clínica.


Aplicabilidad y utilidad práctica de los resultados en el área de la salud

El desarrollo de las técnicas bioquímicas y moleculares para el diagnóstico de la enfermedad de NPC y el estudio de la correlación entre el tipo de mutación, el fenotipo bioquímico, el cuadro clínico y su evolución nos permitirá:

1.- Establecer la prevalencia de las alteraciones genéticas responsables de estas enfermedades entre la población española afecta (y sus familiares). 

2.- Ampliar las posibilidades diagnósticas y de prevención (detección de portadores y diagnóstico prenatal) de esta enfermedad. 

3.- Aportar criterios para la evaluación del tipo de terapia más idónea a considerar en cada caso o sobre la evolución natural de la enfermedad.


Duración del estudio y ayuda solicitada

El tiempo previsto para la realización del presente proyecto según los objetivos planteados se estima en dos años con posibilidad de ampliación un año más según resultados obtenidos. Aunque creemos importante considerar la posibilidad de ampliación un tercer año según los resultados obtenidos.

Para la realización de todos los objetivos, se precisará un becario titulado superior con experiencia en biología molecular, con dedicación exclusiva a este proyecto ya que implica un volumen importante de trabajo y un becario a tiempo parcial titulado superior para la creación de la base de datos.